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Após deixar escapar o inimigo, Ezio passa por um período de descanso em Monteriggioni, quando os Borgia o atacam sem o menor aviso. Agora mais velho e mais experiente, Ezio comanda um contra-ataque contra um verdadeiro exército de templários, mas logo se depara com um novo e mortal inimigo, Cesar Borgia, que assassina seu tio Mario bem em sua frente, partindo após deixar Monteriggioni destruída e feridas que demoram a sarar. A nova aventura ruma para seu cenário principal: a gigantesca Roma, com Coliseu e tudo.